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酶免疫技术的特点方法原理
免疫酶技术是指在一定的生物反应器内,利用酶的催化作用,进行物质转化的技术.其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。下面是小编给大家酶免疫技术的特点方法原理，希望能帮到大家!
酶免疫技术的特点
(1)酶和酶作用的底物：
①辣根过氧化酶(HRP)：是一种糖蛋白，含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。在反应中H2O2是受氢体底物，DH2无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色，此即HRP作为示踪物的原理。
②碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。
③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。
(2)酶标记的抗体或抗原：
称为结合物。制备方法通常有戊二醛交联法(包括有一步法和二步法)和过碘酸盐氧化法。标记抗体的最佳用量：通常采用棋盘滴定法进行滴定。
(3)固相载体：
主要试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体物质最常用的是聚苯乙烯。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。聚苯乙烯作为ELISA固相载体，载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒。聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
(4)免疫吸附剂：
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
酶免疫技术的方法
ACA(抗心磷脂抗体)主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。
其主要程序为用纯心磷脂的无水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封闭后分别于标本孔和对照孔中加入一定稀释度的被检血清及阳性与阴性对照血清，之后加入酶标二抗和酶底物，终止反应后肉眼观察结果或测吸光度(A)值。
具体步骤如下：
预步骤：先用一定浓度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。
(1) 用微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育30min。
(2) 用PBS液洗板3次，每次3min，甩干。
(3) 每孔加入酶结合物2滴，370C水浴箱温育30min。
(4) 用PBS液洗板3次，每次3min，甩干
(5) 每孔分别加入显色A液、B液各1滴，混匀。370C水浴箱温育5-10min。
(6) 取出肉眼观察结果。如待检血清溶液与阳性对照一致均为蓝色，表明待检血清为ACA+血清。
酶免疫技术的技术原理
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验(ELISA)，它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔)上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白(抗抗体)与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。
常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)，相应的底物分别是邻苯二胺(OPD)和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度(OD)值以反映抗原含量。
酶免疫技术基本原理及种类
一、基本原理
酶联免疫技术和其他免疫技术一样,都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的,其差别在于酶免疫方法以酶或者辅酶标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应,使检测水平接近放射免疫测定法。酶免疫测定法可分为非均相免疫测定法和均相免疫测定法,非均相法又有固相法和液相法之分。实践中,常用的是非均相酶固相免疫测定法即 ELISA 法,该法将抗原或抗体结合到固相载体表面,将抗原或抗体相关物质与酶交联成酶结合物,一方面保持了与相应抗原或抗体结合的免疫特性,另一方面还具有酶活性。当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后,则形成酶标抗原-抗体复合物,复合物上的酶遇到相应底物时,可以催化产物水解、氧化或还原,从而产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度,即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在、数量多少,从而达到定性和定量测定的目的。ELISA 测定原理见图1-1。
图1-1 ELISA 测定原理示意图
二、ELISA 的种类
在实际应用中 ELISA 技术主要有直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法、捕获包被法、ABS-ELISA 法、PCR-ELISA 法、A 蛋白酶联法、斑点免疫吸附法和组织印迹法等几种类型,下面主要介绍几种常用的方法,分别是直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法、捕获包被法。
1、直接法测抗原
(1)将受检抗原吸附于固相载体表面,洗涤除去其他未结合物质。
(2)加入酶标记的抗体,形成酶-抗体-抗原复合物,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(3)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。
试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合作标记,费用相对提高。
2、间接法测抗体
(1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加受检抗体。标本中的抗体与固相抗原结合,形成固相抗体-抗原复合物。洗涤除去其他未结合物质。
(3)加酶标二抗。固相免疫复合物上的受检抗体与酶标二抗结合。彻底洗涤未结合的酶标二抗。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗体的量相关。
(4)加底物显色,固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗体的量。
间接法的优势为:二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性;缺点为交互反应发生的概率很高。
3.双抗体夹心法检测抗原
(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)加受检抗原。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原-抗体复合物,洗涤除去其他未结合物质。
(3)加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合,彻底洗涤未结合的酶标抗体,此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
(4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。
这种双位点夹心法具有很高的特异性,常用于检测抗原。
4、竞争法测定抗原
(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)向待测管中加受检标本和一定量的酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量,洗涤。
(3)加底物显色。参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。
竞争法一般用于抗原中的杂质不容易去除,或者抗原的特异性差的情况下。
5、捕获包被法测定抗体
血清中针对某些抗原的特异性 IgM 常和特异性 IgG 同时存在,后者会干扰 IgM 抗体的测定。因此,测定 IgM抗体多用捕获法,先将所有血清 IgM(包括特异性 IgM 和非特异性 IgM)固定在固相上,在去除 IgG 后再测定特异性 IgM。
(1)将抗人 IgM 抗体连接在固相载体上,形成固相抗人 IgM,洗涤除去杂质。
(2)加入稀释的血清标本。血清中的 IgM 抗体被固相抗体捕获,洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
(3)加入特异性抗原试剂。它只与固相上的特异性 IgM 结合,洗涤。
(4)加入针对特异性的酶标抗体,使之与结合在固相上的抗原反应结合,洗涤。
(5)加底物显色,如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在,是为阳性反应。
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