肠道微生物研究中T-RFLP分析技术的运用论文
摘要：限制性末端片段长度多态性分析技术（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP）具有高通量，低成本，低劳动力等特点，是微生物生态学家在探索群落结构，功能及其动态变化中的一项实用方便的工具。自2012年至今，T-RFLP在肠道微生物领域研究方向不断拓宽，随后T-RFLP技术被更多的应用于人体相关疾病与肠道微生物关系的研究中。尽管T-RFLP技术仍存在不足，但随着16Sr RNA基因序列数据库和引物的改进，数据生成和分析统计工具的运用，T-RFLP最终将能在各个领域体现其价值，为人类疾病研究事业带来贡献。
关键词：限制性末端片段长度多态性分析；肠道菌群；动态变化；多样性
1 T-RFLP 技术简介
1.1 T-RFLP 技术原理
T-RFLP分析技术是一种利用对细菌基因组中的保守序列（如16Sr DNA）的T-RFs长度的多态性分析进而实现对细菌分型的群落研究技术。该技术的基本原理是根据靶序列的保守区设计通用引物，以荧光标记引物的5‘末端，并用限制性内切酶对目标片段进行酶切，随后以待分析样的总DNA为模板进行PCR扩增，再选用合适的限制性内切酶消化扩增产物。由于核苷酸序列在不同菌的扩增片段中存在差异，酶切位点也不尽相同，据此得到不同长度的限制性片段。最后对消化后的产物进行自动测序仪测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测并可用T-RFs反映了微生物群落的组成情况。因此可用全部带有荧光的T-RFs的长度和丰度代表群落结构的多样性。
1.2 T-RFLP 分析肠道微生物的主要步骤
T-RFLP分析肠道微生物的主要步骤包括：（1）DNA的提取；（2）标记引物分子PCR扩增；（3）扩增产物的纯化、酶切；（4）结果测定及分析。
1.3 T-RFLP 技术评价
随着T-RFLP的广泛运用，T-RFLP技术在关键环节上的不足也被暴露出来，本部分主要将T-RFLP技术与另一指纹图谱技术DGGE的优缺点进行比较（表1）。
2 技术在肠道微生物研究方面的应用
2.1 T-RFLP 的实验对象的发展
啮齿类动物、哺乳动物、环节动物、鱼类、禽类和人类等均可作为T-RFLP检测的实验对象。T-RFLP早年的实验对象多为鱼类、禽类、啮齿类动物、哺乳类动物等，自2012年至今，T-RFLP研究领域不断拓宽，从大鼠，小鼠等实验动物阶段到广泛应用于养殖业以及野生动物保护研究。随后， T-RFLP技术被大量运用于与人体相关的饮食因素，疾病研究当中。Akira Andoh等[4]通过将患者与健康受试者肠道的微生物组成进行组间及组内对比后发现患者与受试者，发现病人肠道内含有健康个体没有的胃瘤球菌属、真细菌、梭菌、γ-变形菌、非典型的拟杆菌和非典型乳杆菌，得出克莱恩病（Crohn'sdisease）与肠道菌群的`组成有关系。Katsuyuki Fukuda等[5]通过对患不同类型化脓性大肠炎病人的肠道微生物进行T-RFLP分析，再对其结果进行线性判别分析并计算出判别系数后发现，判别系数与化脓性大肠炎的活动性程度有关，提示可以通过判别系数DS对化脓性大肠炎的活动性进行预测与判断。
2.2 T-RFLP 具体方法的应用发展
T-RFLP的方法分为单荧光T-RFLP和双荧光T-RFLP,张慧等[6]建立的双荧光T-RFLP在准确性和灵敏性方面，与传统T-RFLP技术相比基本一致或优于。通过参数优化，可以在保证准确度的前提下，获得较高的灵敏度。由于单荧光T-RFLP成本低廉，检测结果的准确性和灵敏度可以满足大多数实验要求，近些年，大部分研究使用的均为单荧光T-RFLP.
T-RFLP检测过程涉及引物、酶、荧光素等。常见的真菌引物为ITS1F、ITS4R,古生菌引物为Ar3f、Ar927r,常用的细菌引物为27F、8F、63F、7F、1492R、1510R等，荧光一般标记27F、8F、63F引物的5’端，其中27F和8F最为常用。目前常用的荧光物质有6-羧基荧光素、NED、Cy5、D4荧光素等。T-RFLP技术一般用引物扩增细菌片段16Sr RNA和16Sr DNA,真菌的扩增片段是ITS序列，古生菌为16Sr RNA.用于酶切PCR扩增产物的限制性内切酶较多，其中Msp I、Hha I、Hae III、Rsa I比较常用；随着T-RFLP技术的发展，限制性内切酶种类也越来越多，近两年相继出现了实验使用限制性内切酶Bfa I和Alu I.
2.3 肠道菌群数据分析方法进展
可用于T-RFLP数据分析的方法较多。原始T-RFLP数据可以利用TAP-T-RFLP和T-RFPred等在线工具，用一些抑制酶和其相关的“T-RFs”模式的预测对16Sr RNA基因（库）进行电子消化后分析。最近，一些应用如系统赋值工具（PAT），T-对齐（T-Align），ARB集成软件工具，TRF-CUT,TRi FLe和T-RFLP统计数据分析软件[7]等被运用的较多，其可用于完成剖面对比、树状图形式等任务从而对数据和相似性的表达进行统计分析。在众多分析方法中，一般而言，PCA,MDS,SOM和AMMI推荐用于群落成员之间相似性和差异性的可视化处理；集群分析和贝叶斯分析用于分群鉴定；CCA和RDA用于将微生物群落变化与环境的变化联系起来[8].
3 技术前景展望
T-RFLP技术尽管还存在不足，但毋庸置疑，其仍然是现今最好的分析微生物群落结构的工具之一。将来，随着16Sr RNA基因序列数据库和引物的改进，数据生成和分析过程中精制协议和统计工具的运用以及分析方法的分辨率和分析技术的不断提高，T-RFLP最终将能在肠道微生物群落结构，微生物与环境、宿主之间的关系等方面将发挥更大的作用。随着时间的推移，我们有理由相信T-RFLP技术将会越来越成熟，也将在人肠道菌群与人类健康的研究领域中发挥重要的作用。
参考文献：
[1]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[2]孙庆华，柏耀辉，赵翠 等。DGGE、T-RFLP、LH-PCR 对两种活性污泥的微生物种群多样性分析的比较[J].环境工程学报，2009（8）：1365-1369.
[3]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[4]Akira Andoh,Toshio Kobayashi et al.;Characterization of gutmicrobiota profiles by disease activity in patients with Crohn'sdisease using data mining analysis of terminal restrictionfragment length polymorphisms;Biomedical Reports 2014（2）：370-373.
[5]Katsuyuki Fukuda,Yoshiyuki Fujita;Determination of the dis-criminant score of intestinal microbiota as a biomarker ofdisease activity in patients with ulcerative colitis;BMC Gas-troenterology 2014（14）：49.
[6]张惠。双荧光 T-RFLP 方法的建立及应用[D].大连海事大学，2012.
[7]Ricke P, Kolb S, Braker G Application of newly developed ARBsoftware- integrated tool for in silico terminal restrictionfragment length polymorphism analysis reveals the dominanceof a novel pmo A cluster in forest soil. Appl Environ Microbiol,2005（71）：1671-1673.
[8]Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR Impact of culture indepen-dent studies on the emerging phylogenetic view of bacterialdiversity. J Bacteriol,1998（180）：4765-4774.
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