关于微生物生长的几种检测方法

　　一、生长量测定法

关于微生物生长的几种检测方法

　　1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。

　　通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

　　1.2称干重法：

　　可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

　　1.3比浊法：

　　微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。

　　1.4菌丝长度测量法：

　　对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长

　　二、微生物计数法

　　2.1血球计数板法:

　　血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

　　2.2染色计数法：

　　为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

　　2.3比例计数法：

　　将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

　　2.4液体稀释法：

　　对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（mostprobablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

　　2.5平板菌落计数法：

　　这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定

　　体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

　　2.6试剂纸法：

　　在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

　　2.7膜过滤法：

　　用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

　　2.8生理指标法：

　　微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。

　　2.9测定含氮量：

　　大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

　　2.10测定含碳量：

　　将少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

　　2.11还原糖测定法：

　　还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生(转载于:mHg）的条件下才能生长，他们有完整的呼吸链，以分子氧为最终氢受体，具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。

　　兼性厌氧菌:它是以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的'微生物，有时也称“兼性好氧菌”。

　　微好氧菌:只能在娇滴滴额氧分压（1.33~3.Pa，正常大气中的氧分压为0.2bar）下才能正常生长的微生物。

　　耐氧菌:耐氧性厌氧菌的简称，是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。

　　厌氧菌:有一般厌氧菌与严格厌氧菌（专性厌氧菌）之分。

　　超氧阴离子自由基:活性氧的形式之一，因有奇数电子，故带负电荷；它既有分子性质，又有离子性质；其性质极不稳定，化学反应力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。

　　超氧化物歧化酶(SOD):保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金属辅基的不同分三类：1、含Cu、Zn的SOD，存在于几乎所有真核生物的细胞质中；2、含Fe的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在于真核生物的线粒体中。SOD除可清除超氧阴离子自由基外，还发现在防治人体衰老、治疗自身免疫性疾病、抗癌、防白内障、治疗放射病和肺气肿以及解除苯中毒等方面有一系列疗效。

　　PRAS培养基:用严格厌氧方法配置、分装、灭菌后的厌氧菌培养基，称为预还原无氧灭菌培养基，即PRAS培养基。

　　厌氧罐:培养厌氧菌的装置。

　　亨盖特滚管技术:一种集制备高纯氮、以氮驱氧和全过程实现无氧操作、无氧培养、无氧检测于一体，用于研究严格厌氧菌的技术和装置。

　　厌氧手套箱:一种用于无氧操作和培养严格厌氧菌的箱形密闭装置。

　　摇瓶培养:一般将三角瓶内培养液的瓶口用8层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同时减少瓶内装液量，把它放在往复式或旋转式摇床上作有节奏的震荡，以达到提高溶氧量的目的。

　　曲:是一类用麸皮、米糠等疏松的固体营养料接种、培养微生物而制成的含氧活菌产品。

　　曲法培养:将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄地铺在培养容器表面，使微生物即可获得充足的氧气，又有利于散发热量，对真菌来说，还有利于产生大量孢子。

　　通风曲:一种机械化程度和生产效率都较高的现代大规模制曲技术，在我国酱油酿造业中广泛应用。

　　污染:有害微生物通过气流、水流、接触和人工接种等方式，传播到合适的基质或生物对象上而造成种种危害。

　　巴氏消毒法:有发过微生物学家巴斯德用于果酒消毒，故名。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的也太风味食品或调料的低温消毒方法（一般在60-85度下处理30min至15s）。有两种方法：1、低温维持法；2、高温瞬时法。

　　间歇灭菌法:适用于不耐热的培养基灭菌。方法是：讲带灭菌的培养基放在80-100度下蒸煮15-60min，以杀灭其中所有的微生物营养体，然后放至室温37度下保温过

　　夜，诱使其中残存的芽孢发芽，第二天再以同样方法蒸煮和保温过夜，如此重复3天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的效果。

　　连续加压蒸气灭菌法:让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。

　　梅拉特反应:高温灭菌时，培养基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）的游离氨基与羧基化合物（糖类）的羰基间发生复杂的化学反应，导致培养基褐变同时，还降低了有关营养物成分，故应设法避免。

　　石炭酸系数:一定时期内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效果的石炭酸的最高稀释度之比。

　　抗生素:一类有微生物或其他生物生命活动过程中合成的此生代谢产物或其人工衍生物，他们在很低浓度时就能一直或干扰他种生物的生命活力，因而可用作有两的化学治疗剂。

　　抗代谢药物:一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质。3种作用：1、与正常代谢物一起共同竞争酶的活性中心，从而使微生物正常代谢所需要的重要物质无法正常合成，例如磺胺类；2、“假冒”正常代谢物，使微生物合成出无法正常生理活动的假产物，如8-重氮鸟嘌呤取代鸟嘌呤而合成的核苷酸就会产生无正常功能的RNA；3、某些抗代谢药物与某一生化合成途径的终产物结构类似，可通过反馈调节破坏正常代谢调节机制，例如，6-巯基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

　　选择毒力:大于病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。

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