辐照灭菌剂量确认的微生物学方法

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辐照灭菌剂量确认的微生物学方法

　　《微生物学方法》主要介绍微生物学研究方法论、技术原理和研究工具。内容简介微生物学领域正经历跨越式的发展，创新方法层出不穷。下面是小编带来的辐照灭菌剂量确认的微生物学方法，希望对你有帮助。

辐照灭菌剂量确认的微生物学方法

　　辐照灭菌剂量确认的微生物学方法

　　无菌状态是一个绝对的概念，但是要确定一个体系的无菌状态却是一个概率问题。产品的无菌保证水平是指一个体系经过灭菌操作后达到无菌状态的概率，要确定一个产品的无菌状态，必须要符合欧洲标准EN556的条件，EN556规定无菌保证水平为10-6，即每一百万细菌中有一个存活的概率。

　　ISO11137-2-2006中规定了如何确定辐照产品的无菌保证水平。（医疗器械的灭菌，辐照灭菌，第二部分，灭菌剂量的确认）

　　剂量确认的方法

　　ISO11137-2-2006中有两种方法来确认灭菌剂量使产品达到某一无菌保证水平，分别是方法一和方法二，下面列出了这两种方法的原理和过程。

　　方法一

　　方法二可用来确定：为了达到某一无菌保证水平所需的辐照剂量，在这种方法中，我们需要用到一个反映微生物耐受剂量的标准表格。

　　第一步：测定初始生物负载

　　为了做生物负载分析，至少要分别从三批独立的产品中抽出10个样品进行检测。生物负载分析必须按照一个经验证的、可行的方法进行分析。计算出每一批产品的平均生物负载，用30个样品的平均生物负载作为三批样品的总平均生物负载。如果三批产品中有一批的平均生物负载比总平均生物负载大两倍或两倍以上，就用此批的平均值来做剂量验证，否则，用三批的总平均值来做剂量验证。

　　第二步：获得验证剂量

　　一旦确定了原始生物负载量，就可以运用ISO11137-2-2006标准中的参考表格确定达到10-2灭菌水平的剂量，使用该剂量处理100个样品得出的无菌实验结果，可以外推出10-6无菌保证水平对应的剂量是否合适。使用该参考表格时，产品中实际平均生物负载量应小于或等于表格中列出的生物负载量。

　　第三步：进行剂量验证试验

　　用参考表格确认的验证剂量辐照100个样品，所用验证剂量的相对误差不得超过±10%，然后将辐照后的产品移入无菌实验室进行无菌检测，每100个样品的无菌检测要独立进行。样品于30±2℃培养箱中培养14天，对阳性结果进行计数。培养的14天内，定期观察阳性实验的数目。

　　第四步：结果解析

　　如果100个实验样品中的阳性数目少于2个，则接受该验证剂量。

　　第五步：建立灭菌剂量

　　通过查阅ISO11137-2-2006标准中的表5可以确定达到某一无菌保证水平应采用的灭菌剂量。

　　方法二

　　方法2是用来确定达到某一特定的无菌保证水平所需的辐照剂量。由于微生物对辐照有耐受性，该剂量确定的过程是复杂的，并且需要一系列的计算工作。下面仅接受一下该过程的大致过程。

　　第一步：至少从三批独立产品中分别抽出280份样品进行分析。

　　第二步：每20份产品分别作为一个批次用不同的剂量辐照。至少以9个不同的辐照的剂量、剂量梯度为2kGy(2,4,6,8,…..,18kGy)辐照以上样品，并对剂量进行监测。辐照后的产品分别进行无菌测试。

　　第三步：根据以上无菌试验的结果，查标准估计达到10-2无菌保证水平所需的剂量。通过第二步无菌试验的结果决定选择哪一批产品用来做进一步的无菌试验。从所选批次中选出100个样品用查表得出的剂量进行辐照处理，然后做无菌试验。

　　第四步：无菌试验的结果作为计算最低灭菌剂量的依据。

　　VDmax方法——25kGy或15kGy作为灭菌剂量的证实

　　ISO11137-2-2006中也列出了如何对两种灭菌剂量（25kGy、15kGy）进行验证的方法。这种方法被称为VDmax方法，和方法1的操作方法相似，因为该方法也需要进行原始生物负载量测定、剂量验证和无菌试验。

　　第一步：测定初始生物负载

　　至少从三批产品中抽出10份产品做生物负载分析。生物负载分析必须按照一个经验证过可行的方法进行分析。计算出每一批产品的生物负载，用30个样品的平均生物负载作为三批样品的总平均生物负载量。如果三批产品中有一批的平均生物负载量比总平均生物负载量大

　　两倍或两倍以上，就用此批的平均值来做剂量确定，否则，用三批的总平均值来做剂量确定。平均生物负载的最大允许值如下：

　　VDmax25kGy1000cfu/件

　　VDmax15kGy1.5cfu/件

　　第二步：进行剂量验证试验

　　初始生物负载确定后，则可确认验证剂量。通过查ISO11137-2-2006中的表9得出所需验证剂量。并按验证剂量对一批产品中的10份样品进行辐照处理。无菌保证水平为10-2。然后对10份辐照样品进行无菌试验。

　　第三步：结果解析

　　如果10份样品中不超过一份样品显示阳性，则接受设定的验证剂量，所选的灭菌剂量被验证。如果2份样品显示阳性，必须做第二次剂量验证。

　　第四步：灭菌剂量验证

　　从另一批样品中选出10分样品用灭菌剂量（VDmaxDose）进行辐照，对辐照后样品进行无菌试验，如果没有阳性结果出现，则所选灭菌剂量（VDmaxDose）验证通过。

　　日常灭菌剂量审核

　　日常剂量审核用来反映所建立的灭菌剂量的持续有效性，日常剂量审核是为了反映初始微生物负载对辐照的耐受性。

　　两种方法可用来确定日常剂量审核的周期。

　　选择3个月审核一次。

　　执行剂量审核之前对剂量审核的周期的选择要做合理的说明。

　　ISO11137-2-2006中有关于前期灭菌剂量审核结果的标准和产品生物负载的稳定性的标准。最大的灭菌剂量审核周期是12个月。

　　微生物实验室常用消毒、灭菌方法

　　微生物实验室常用的器材一般包括玻璃器材、金属器械、橡胶制品及塑料制品等，每类器材的处理及消毒措施都有不同。严格的消毒灭菌工作极为重要，直接影响着整个实验能否顺利进行。

　　（一）常见消毒灭菌方法

　　目前，常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如，干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线消毒法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

　　1.干热灭菌法

　　是利用恒温干燥箱内120℃～170℃的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。

　　2.湿热灭菌法

　　压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1 kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。

　　3.射线消毒法

　　利用紫外线灯进行照射消毒的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面消毒。消毒时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。

　　4.过滤除菌法

　　是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。

　　目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。

　　5.化学消毒剂消毒法

　　用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌;利用甲醛加高锰酸钾[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。在使用时应注意安全，特别是用在皮肤或实验材料上的消毒剂，须选用合适的药剂种类、浓度和处理时间，才能达到安全和灭菌的目的。

　　6.抗生素抑菌法

　　主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。

　　(二)不同种类物品及培养物的消毒灭菌方法

　　1.无菌操作室消毒

　　培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的消毒是至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒，熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的消毒。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30min，进行空气消毒。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

　　2.培养液灭菌

　　培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。

　　使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35~0.4 kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1 kg/cm2为121℃，保持15~20min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。在121℃的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0～1.1 kg/cm2、121℃。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表2-3)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在40℃左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。

　　使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35~0.4 kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1 kg/cm2为121℃，保持15~20min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。在121℃的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121℃。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表2-3)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在40℃左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。液体培养液在冷却到室温后再加入过滤除菌溶液。过滤除菌时，使用孔径为0.22～0.45μm或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应进行高压消毒灭菌，温度不应超过121℃。

　　3.玻璃器皿、塑料器皿和器械灭菌

　　玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌后最好及时烘干水分。对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫外线重复杀菌。实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进行消毒，消毒后的器皿要充分散气2～4小时后才可使用。无菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线重复杀菌;在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。

　　4.培养材料的消毒灭菌

　　采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10~12%，浸泡5~15 min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。

　　灭菌程序验证内容

　　撰写验证方案及制定评估标准。

　　确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行。

　　确认关键设备控制仪表在规定的参数范围内能正常运行。

　　采用被灭菌物品或模拟物品进行重复实验确认灭菌效果符合规定。

　　完善文件记录，撰写验证报告。

　　灭菌程序运行监控

　　关键参数应在验证确定的范围内：温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度、辐照剂量等。

　　灭菌程序定期验证，时效不超过半年。

　　灭菌设备或程序发生变更重新进行验证。

　　灭菌保证

　　灭菌效果与灭菌前产品污染程度及污染菌特性有关，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各个环节降低污染程度。