公卫执业医师考点：包虫病诊断标准附录C

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公卫执业医师考点：包虫病诊断标准附录C

　　人体包虫病免疫学诊断方法有间接红细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PVC薄膜快速ELISA等。其中，以ELISA法最为常用且较敏感。现有的包虫病免疫学试验方法在敏感性和特异性上存在很大的差异。试验结果受许多因素的影响：抗原的性质和质量;检测用的试验系统;棘球蚴囊的数量、部位和活力;不同地理虫株差异;个体免疫应答反应的差异等。约10%～40%的手术确诊的包虫病患者用目前已知的抗原检测不到特异性抗体。本规范中列出了国内外普遍应用的一些方法。

　　C.1 抗原制备

　　C.1.1囊液粗抗原：完整的棘球蚴组织表面清洗干净消毒后，无菌抽取囊液(宜使用无化脓和无钙化的可育囊)。将囊液经5000 r/min离心20 min，上清液冻存备用。

　　C.1.2 纯化抗原

　　可用磷钨酸、氯化镁沉淀法对棘球蚴囊液抗原进行部分纯化。取20ml离心后的囊液上清，加入2mol/L MgCl2和4%磷钨酸(用NaOH调节pH至7.5～7.6)各1.2ml;室温搅拌5 min，5000r/min 离心30 min;将沉淀用0.02mol/LpH7.2 PBS溶解;4oC 透析24小时，测定蛋白浓度，～20 oC冻存。

　　C.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

　　C.2.1 抗原

　　囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原。

　　C.2.2 操作方法

　　C.2.2.1 抗原包被：用0.05 mol/L pH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至工作浓度，每孔加入100 μl，置温盒4℃过夜。次日，倾去抗原，用含0.05%吐温～20的磷酸盐缓冲液(0.02mol/L .pH7.4 PBST)洗涤3次，每次3 min，拍干;

　　C.2.22 加待检血清：血清用含3%BSA的PBST 1∶200稀释，每孔加入100 μl，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，37℃ 1 h，取出倾去血清，同前洗涤3次;

　　C.2.2.3加酶标记第二抗体：加入工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG 100 μl，37℃，1 h，倾去第二抗体，同前洗涤;

　　C.2.2.4 加底物显色：加邻苯二胺(OPD，橙红色)或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐(TMB/TMBS，蓝色)底物溶液100 μl，37℃，30 min;

　　C.2.2.5 加终止液：2 mol/L . H2SO4 50 μl.

　　C.2.3 结果判断

　　在酶标仪上读取492 nm(OPD)或450 nm(TMB/TMBS)吸光值，以待测样本(S)对阴性对照血清(N)的S/N≥2.1为阳性临界值。

　　C.3 间接红细胞凝集试验(IHA)

　　C.3.1 红细胞醛化

　　C.3.1.1 从绵羊颈静脉无菌采血100ml，加入200ml～400ml阿氏液(400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2g、NaCI 1.68g、柠檬酸三钠2.4g和柠檬酸0.22g，调pH至6.1，高压或过滤除菌)中，混匀抗凝。3000 r/min离心15 min，弃上清;

　　C.3.12 用生理盐水洗涤红细胞3次，同上离心。沉淀中加入50ml生理盐水和100ml PBS(0.15 mol/L ，pH8.0)混匀;

　　C.3.13 加入经10% Na2CO3中和的戊二醛300ml(10% Na2CO3 75ml与25%戊二醛225ml混合)于磁力搅拌器4℃缓慢搅拌24 h;

　　C.3.14+ 离心弃上清，沉淀用生理盐水洗涤5次。最后，将红细胞沉淀用含0.1% NaN3的生理盐水配成10%细胞悬液，4℃保存。

　　C.3.2 红细胞致敏

　　C.3.2 1.将10%戊二醛醛化的绵羊红细胞20ml 用生理盐水300ml 洗3次(3000 r/min，5 min)，红细胞压积约为2ml;

　　C.3.2 .2加入生理盐水98ml，将红细胞配成2%悬液100ml;

　　C.3.2. 3与1：10000鞣酸100ml混合于37 oC水浴30 min，每10 min混旋一次;

　　C.3.2. 4同步骤1离心洗3次，弃上清;

　　C.3.2. 5沉淀加入生理盐水198ml，将鞣化红细胞配成1%悬液200ml;

　　C.3.2. 6.与稀释好的囊液抗原200ml 混合，37 ℃水浴30 min，每10 min混旋一次;

　　C.3.2. 7离心弃上清，用1%兔血清PBS(0.15 mol/L pH7.2 PBS)洗3次，弃上清;

　　C.3.2. 8 用10%兔血清PBS 18ml将红细胞配成10%致敏红细胞20ml.置4℃冰箱保存。

　　C.3.3 操作方法

　　C.3.3.1 准备抗原：用0.15 mol/L pH7.2 PBS将10%致敏红细胞保存液稀释至1%备用;

　　C.3.3.2血凝板每孔加入25 μl PBS;

　　C.3.3.3第一孔加入待检血清25 μl，用移液器或稀释棒从第一孔开始逐孔向后稀释;

　　C.3.3.4每孔加1%致敏红细胞25 μl，振荡混合3 min，置37℃反应1h，判定结果;

　　C.3.3. 5.对照设置：每批试验均应设置阳性、阴性和红细胞对照(红细胞对照孔只有PBS和致敏红细胞)。

　　C.3.4 结果判断

　　C.3.41 阴性反应：红细胞全部沉入孔底呈点状，边缘光滑;

　　C.3.42阳性反应：++++ 100%红细胞凝集;+++ 75%红细胞凝集;++ 50%红细胞凝集;+ 25%红细胞凝集。

　　以血清1∶128稀释出现阳性反应者(++)判为血清抗体阳性。

　　C.4 PVC薄膜快速ELISA

　　C.4.1 抗原

　　囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原

　　C.4.2 操作方法

　　C.4.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜软板，编号，用PBST洗1次，然后每孔加PBST 200 μl;

　　C.4.2.2 加待检血清及参考血清(每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔)每孔10 μl，混匀，置湿盒37℃ 5 min(或25℃室温10 min)。倾去血清，用PBST连续洗8次，甩干;

　　C.4.2.3加酶标抗体：每孔加工作浓度酶标抗体 200 μl，37℃ 5 min，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干;

　　C.4.2.4 加底物显色：每孔加TMB底物200 μl，反应5 min～10 min(TMB底物溶液的制备：TMB 50 mg溶于10ml二甲基亚砜中作为母液，4℃保存。用前取母液1ml+pH 5.0柠檬酸缓冲液50ml+30% H2O2 8 μl)。

　　C.4.3 结果判断

　　参照阴性及阳性对照，用目视法判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。

　　C.5 免疫印迹技术(Western blot，WB)

　　C.5.1 抗原膜制备

　　囊液粗抗原、原头节粗抗原或特异性纯化抗原进行常规SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶浓度为15%，抗原蛋白经SDS～PAGE电泳分离后，再转移到硝酸纤维膜上。经Ponceau S染色，标记标准分子量位置。将抗原膜用封闭液(3%脱脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐温～20)封闭1 h后将膜裁成宽2-3 mm的膜条备用。此抗原膜条，可夹在PBS湿滤纸中封于塑料袋内，4℃保存备用。若置低温冰箱中，可长期保存。

　　C.5. 2 操作方法

　　C.5.2.1 将抗原膜置于反应槽中，加入用封闭液(3 %脱脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐温～20)1：100稀释的待检血清，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇2 h(4℃可过夜)。次日，用上述封闭液洗4次，每次5 min;

　　C.5.2.2加入工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG，室温2 h，同前洗涤;

　　C.5.2.3加入二氨基联苯胺(DAB，棕色)显色至清晰后，蒸馏水终止反应，将反应膜干燥保存。

　　C.5.3 判读结果

　　细粒棘球蚴特异性反应条带：8 kDa、16 kDa、20-24 kDa(AgB)和38 kDa(Ag5)

　　多房棘球蚴特异性反应条带：18 kDa(Em18)、54 kDa(Em2)和220 kDa(EmAP)

　　C.6 循环抗原检测(circulating antigen，cAg)

　　C.6.1 特异性单克隆或多克隆抗体的制备

　　C.6.1.1用粗抗原或特异性抗原免疫Balb/c小鼠，按常规方法进行细胞融合、阳性细胞克隆筛选和鉴定，将分泌特异性单克隆抗体的细胞株腹腔注射小鼠，获得单克隆抗体腹水;

　　C.6.1.2 用粗抗原或特异性抗原免疫兔，获得高效价的多克隆抗体;

　　C.6.1.3建立可检测粗抗原或特异性抗原的敏感的双抗体夹心ELISA方法;

　　C.6.1.4用建立的双抗体夹心ELISA反应系统检测病人血清中的cAg.

　　C.6.2 循环抗原检测