γ-谷氨酰转肽酶的化学性质分析

　　随着研究的深入，人们对γ-GTP的催化功能和分子结构有了更多的了解，并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志，被广泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[3-4] 。近年来，由于生物技术发展突飞猛进，生物催化与生物转化技术在工业生产中逐渐兴起，利用γ-GTP制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。已有报道利用γ-谷氨酰基化（γ-glutamylization）反应合成了GG-DOPA等多种化合物[5-7]。地衣芽孢杆菌所产生的γ-GTP在25~35 ℃的温度范围有较好的稳定性，在50 ℃的温度下保存20 min酶活力基本丧失，这为进一步利用该酶转化生产茶氨酸时的温度条件提供了依据。该酶对酸性环境无耐受性，适宜在碱性条件下保存，在pH低于11的碱性条件下保存30 min，酶活力基本无损失。利用γ-GTP生产茶氨酸需要反应体系pH 为10[9]，而该酶在此pH下比较稳定，说明地衣芽孢杆菌所产生的 γ-GTP适合于酶法转化生产茶氨酸。

γ-谷氨酰转肽酶的化学性质分析

　　1材料与方法

　　1.1主要材料与试剂

　　菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）由本实验室筛选获得。试剂：Tris 购自北京普博欣生物公司；L-γ-谷氨酰对硝基苯胺、双甘肽均购自广州威佳科技有限公司；硫酸铵为国产分析纯。

　　1.2地衣芽孢杆菌的产酶发酵

　　用接种环在活化好的.菌种斜面上刮下一环菌种，将其转入到种子培养基，30 ℃、240 r/min摇床振荡培养16 h。以20%接种量转接于发酵培养基（30 mL发酵液/300 mL三角瓶）中，在30 ℃下240 r/min摇床培养28 h后收集菌体。

　　1.3γ-GTP粗酶的制备

　　γ-GTP发酵瓶培养液离心（4 800 r/min,10 min），弃上清液，用TE缓冲液（Tri-HCl 缓冲液，pH 8.0，10 mol/L）重悬菌体，采用溶菌酶法以及硫酸铵盐析法制备粗酶液。

　　1.4酶对温度的耐受性

　　以TE pH8.0为缓冲液，不同温度下保存20 min，测定酶活力[1]。

　　1.5酶对pH的耐受性

　　pH2.0采用Na2HP04柠檬酸缓冲液； pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc缓冲液；pH7.0采用磷酸盐缓冲液；pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl缓冲液；pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH缓冲液；在25 ℃下保存30 min，测定酶活力。

　　1.6酶的最适反应温度

　　以TE pH8.0为缓冲液，分别在不同温度下测定酶活力。

　　1.7酶的最适反应pH

　　pH2.0采用Na2HP04-柠檬酸缓冲液； pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc缓冲液；pH7.0采用磷酸盐缓冲液；pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl缓冲液；pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH缓冲液，采用酶活测试方法检测酶活力。

　　1.8金属离子对酶活力的影响

　　在反应体系中分别加入各种金属离子，终浓度均为5 mmol/L，采用酶活测试方法检测酶活力。

　　2结果

　　在一般情况下，适合的金属离子及适合的浓度会对酶的催化活性产生促进作用，但如果反应体系中金属离子浓度过高，反而会对酶蛋白产生毒害作用。为此，可选择对γ-GTP影响较大的镁离子研究浓度与酶活力的关系。

　　Mg2+浓度对酶活力的影响比较显着。在低于3.0 mmol/L的浓度范围内，酶活力随着Mg2+浓度的增加而增高，当浓度达到3.0 mmol/L时酶活力最高，此后，酶活力随着Mg2+浓度上升而缓慢下降。由此可见，在图5所涉及的金属离子（除亚锡离子外）虽然在5 mmol/L的浓度下对酶活力均有促进作用，但在不同浓度下有些金属离子也会对酶起到抑制作用。

　　在反应体系中加入5 mmol/L的各种金属离子除亚锡离子外均会对酶的活力有促进作用。但在金属离子中，一价金属离子钾离子和钠离子以及三价金属离子铁离子和铝离子的加入对酶的促进作用明显低于二价金属离子锰离子、钙离子和镁离子。另外，添加重金属离子亚锡离子由于会引起蛋白质的变性，致使酶活力消失；有的金属离子如锰离子、镁离子等可较大程度的提高酶活力，这可能是由于这些金属离子会对γ-GTP的活性中心产生影响的缘故。

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