蛋白质化学试题及答案
蛋白质化学篇一：蛋白质化学作业-答案
蛋白质化学作业
一：名词解释：
等电点：在某一种特定PH的溶液中，某物质以两性离子形式存在，所带的正负电荷总数相等，静电荷数为零，在电场中它即不向正极移动也不向负极移动，此时的PH值为该物质的等电点。
盐析和盐溶：蛋白质溶液中加入中性盐后，因盐的浓度不同可产生不同的反应。低盐浓度时，随盐浓度的增加，蛋白质溶解度增加的现象，称为盐溶。而高浓度中性盐可使蛋白质分子脱水并中和其电荷，从而使蛋白质从溶液中沉淀出来，称为盐析。
蛋白质变性：天然蛋白质分子由于受到物理或化学因素的影响使次级键断裂，引起天然构象的改变，导致其生物活性的丧失及一些理化性质的改变，但未引起肽键的断裂，这种现象称为蛋白质的变性。
结合蛋白：由简单蛋白质即只有氨基酸成分的蛋白质与非蛋白质组分结合而成，其非蛋白质组分通常称为辅基。
蛋白质亚基：是组成蛋白质四级结构最小的共价单位。在具有四级机构的蛋白质中有三级机构的球蛋白称为亚基。它可由一条肽链组成，也可由几条肽链通过二硫键和次级键连接在一起组成。
酰胺平面：肽键中C-N具有双键的性质，因而C-N不能自由旋转，这样使得与它相连的原子都固定在一个平面，这个平面就称为酰胺平面。
诱导契合：酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构互相吻合，但酶的活性中心是亲性的而非刚性的，当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，其上有关的各个集团达到正确的排列和定向，因而使酶和底物契合而结合成中间络合物，并引起底物发生反应。反应结束当产物从原酶上脱落下来后，酶的活性中心有恢复了原来的构象。
二：判断题：
2题对，其余错
三：填空题：
1. 色氨酸、酪氨酸
2. ①二硫键②疏水键③范得华力
3. ①协同 ②变构
4. ①α--氨基②α-羧基③侧链可解离基团
四：选择题：
（1）：1； （2）：3； （3）：2
五：问答题：
1， 什么叫蛋白质的一级、二级、三级、四级结构？维持以上各层次结构的作用力有哪些？
蛋白质一级结构：由氨基酸在多肽链中的数目、类型和顺序所描述的多肽链的基本结构。它排除了氨基酸a-碳原子的构型以外的原子空间排列，同样也排除了二硫键，所以不等于分子的共价结构。维系的作用力氨基和羧基缩合形成的共价键。
蛋白质二级结构：多肽链主链在以及结构的基础上进一步的盘旋或折叠，从而形成有规律的构象，如a-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲等，这些结构又称为主链构象的结构单元。维系的作用力是氢键。二级结构不涉及氨基酸残疾的侧链构象。
蛋白质三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步地盘绕、折叠，从而产生特定的空间结构或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。维系作用力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电作用力），另外二硫键在某些蛋白质中也起非常重要的作用。
蛋白质四级结构：有许多蛋白质有两个或两个以上的具有独立三级结构的亚基通过一些非共价键结合成为多聚体，这些亚基的结构是可以相同的，也可以是不同的。四级结构指亚基的种类数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用。维系作用力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电作用力）。
2, 蛋白质溶液作为亲水胶体，其稳定因素有哪些？它们是怎样起稳定作用的？
①蛋白质分子小(直径在1?100nm之间)。介质(水)分子的布朗运动对蛋白质分子(因小)碰撞的合力不等于零，因此它具有动力学上的稳定性；
②蛋白质分子携带同种电荷。一种蛋白质在一定的pH环境下(等电pH除外)带有同种电荷,因相互排斥而不易聚集沉淀；
③球状蛋白质分子表面具有亲水基团。它们使蛋白质分子表面形成水化层。因而阻碍分子相互靠拢。（5分）
3, 什么是蛋白质的变性作用？引起蛋白质变性的因素有哪些？
蛋白质的变性作用，是指蛋白质立体结构被破坏，使按特定方式折叠卷曲的多肽链由有序状态成为伸展松散的无规则排列状态，变性一般不涉及肽键的断裂，而主要是次级键断裂，破坏了维持蛋白质立体结构条件，使蛋白质构象被破坏。（2分）变性后的蛋白质，溶解度降低，粘度增加，失去活性，失去结晶能力，易于被酶水解。
引起蛋白质变性的因素有两大类：
①物理因素：加热变性使蛋白质沉淀、紫外光、X-射线、超声波、高压?； ②化学因素：
A: 有机溶剂：丙酮、乙醇等有机溶剂有较强的亲水能力，能破坏蛋白质分子周围的水化层，导致蛋白质沉淀析出。
B:重金属盐：Hg2+ 、 Ag+ 、Pb2+等重金属离子可与蛋白质中带负电荷的集团形成不易溶解而沉淀。
C:生物碱试剂：可与蛋白质中带正电荷的集团形成不溶性盐析出。
其中 强酸、强碱、脲、去垢剂、重金属盐、生物碱试剂及有机溶剂等化学因素可引起蛋白质变性。
4, 蛋白质有哪些重要的理化性质？分别举例说明这些重要性质在轻工业中的应用。
1）蛋白质的两性电离及等电点：蛋白质两端的氨基和羧基及侧链中的某些基团，在一定的溶液PH条件下可解离成负电荷或正电荷的基团。如等电聚焦电泳分离蛋白质。
2）蛋白质的沉淀：在适当的条件下，蛋白质从溶液中析出的现象如：丙酮沉淀，破坏水化层。也可用乙醇。盐析，将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，破坏在水溶液中的稳定因素电荷而沉淀。如抢救误服重金属盐中毒的病人。
3）蛋白质变性与复性：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性子的改变和生物活性的丧失，主要为二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。如工业上消毒杀菌及蛋白质的分析分离。
4）蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm处有特征性吸收峰，可用蛋白质含量测定。
5）蛋白质的呈色反应：对生物材料中蛋白质含量测定。
茚三酮反应：经水解后产生的氨基酸，其氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波长处。
双缩脲反应：蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫色或红色。氨基酸不出现此反应。蛋白质水解加强，氨基酸浓度升高，双缩脲呈色深度下降，可检测蛋白质水解程度。
5, 举例说明“蛋白质在生活细胞中含量丰富，功能繁多，是生命活动的体现者。”
1）酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂，代谢反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。
2）结构蛋白参与细胞和组织的建成
3）某些动物激素是蛋白质，如胰岛素、促甲状腺激素等，在代谢调节中具有十分重要的作用
4）运动蛋白如肌肉中的肌动蛋白，肌球蛋白等与肌肉收缩和细胞运动有关
5）高等动物的抗体、补体、干扰素等蛋白质具有防御功能
6）某些蛋白质具有运输功能，如血红蛋白和肌红蛋白运输氧，脂蛋白运输脂累、细胞色素和铁氧还原蛋白传递电子等
7）激素和神经质的受体蛋白有接受和传递信息的功能，如细胞表面抗原参与免疫反应和细胞识别
8）染色质蛋白、阻遏蛋白转录因子等参与基因表达的调控，细胞周期蛋白等具有调控细胞分裂、增值、生长、分化的功能
9）贮藏蛋白、卵有蛋白等具有贮藏氨基酸和蛋白质的功能。
如此看来，蛋白质在生活细胞中含量丰富，功能繁多，是生命活动的体现者。 (以上举例其中3项即可)
6, 简述sephadex-25凝胶层析的原理。
凝胶层析又称凝胶过滤，是种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲溶液洗脱，大分子无法进入凝胶颗粒的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能够自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相中达到动态平衡，所以要花费很长时间流经柱床，使得不同大小的分子得以分离。
四：实验题：
1，有一种由溶菌酶和血清白蛋白组成的混合样品，已知溶菌酶的分子量是13930，pI=11，血清白蛋白分子量是68500，pI=4.8写出将他们分离的两种方法（要求只写出分离原理）。
1）凝胶层析法：将样品加加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲溶液洗脱，大分子无法进入凝胶颗粒的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能够自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相中达到动态平衡，所以要花费很长时间流经柱床，使得不同大小的分子得以分离。
2）电泳法：把溶液调到中性，因溶菌酶和血清蛋白两个等电点各不相同，使得混合液中溶菌酶和血清蛋白带上正负不同的电荷，利用电泳法使它们分离到正负不同的两级而达到分离的目的。
2，有两种二肽化合物Gly-Ala和Lys-Ala，现将他们在pH=8的缓冲液中进行电泳，请画出这两种二肽在电场中的泳动方向。
Gly-Ala的等电点PIPH=8 带正电荷 如图示：
思考题：
在体外，用下列方法处理，对血红蛋白与氧的亲和力有什么影响？
①pH从7.0增加到7.4；
②CO2分压从10torr增加到40torr；
③O2分压从60torr下降到20torr；
④2，3-二磷酸甘油酸(DPG)的浓度从8×10-4mol/L下降到2×10-4mol/L； ⑤α2β2解聚成单个亚基
①pH增加，Hb与氧的亲和力增加。（1分）
②CO2分压增加，Hb与氧的亲和力下降。（1分）
③O2分压下降，Hb与氧的亲和力下降。（1分）
④DPG浓度下降，Hb与氧的亲和力提高。（1分）
⑤α2β2解聚成单个亚基，与氧的亲和力提高。（1分）
2.血红蛋白(Hb)是由两个α-亚基和两个β-亚基组成的四聚体，它的α-和β-亚基的三级结构类似于肌红蛋白(Mb)。但是Mb中许多亲水残基在Hb中却被疏水残基取代。
问:(1)这种现象怎样与疏水残基应折叠到分子内部的原则相一致？
(2)在维持Hb四级结构的作用力方面，你能得出什么结论？
①疏水侧链在血红蛋白亚基表面的某些区域形成疏水面，这样α-亚基和β-亚基能相互紧密的结合在一起形成一定的空间结构。它们的疏水侧链虽然分布在血红蛋白亚基的表面，但就整个血红蛋白分子来看，依然是在血红蛋白分子的内部。（4分）
②疏水作用是维持血红蛋白四级结构的主要作用力。（1分）
蛋白质化学篇二：蛋白质化学考研真题
选择题
1．在生理条件下，下列哪种基团既可作H+的受体，也可作H+的供体。A
A His的咪唑基B Lys的ε－氨基
C Arg的胍基 D Cys的巯基
2．下列哪种氨基酸最易出现在β—转角 B
A Ala B Gly C Leu D Arg
3．在凝胶过滤中，下列哪种分子最先被洗脱下来B
A蛋白A，MW=17，000 B蛋白B，MW=50，000
C蛋白C，MW=10，000D蛋白D，MW=5，000
4．在蛋白质序列研究中，拆开的二硫键用下列哪种试剂保护A
Aβ-巯基乙醇 B碘乙酸 C过碘酸 D 二硫苏糖醇
5．下列哪种情况最可能形成β-折叠 B
A poly Pro B Ala – Val – Ala – Val – Ala – Val
C poly Gly D Gly – Ser –Gly – Ser –Gly – Ser
6.蛋白质分子组成中不含有下列哪种氨基酸?E
A.半胱氨酸B.蛋氨酸
C.胱氨酸 D.丝氨酸 E.瓜氨酸
7. 胰蛋白酶专一水解多肽键中（ ）C
A 碱性残基N端；B酸性残基N端；C碱性残基C端；D酸性残基C端
8.溴化氰(CNBr)作用于()_A
A. 甲硫氨酰-X B. 精氨酰-X C. X-色氨酸
D. X-组氨酸
9.谷氨酸的pK值为2.19，4.25，9.76；赖氨酸的pK值为2.18，8.95，10.53；
则它们的PI值分别为()B
A.4.25和8.95 B.3.22和9.74C.6.96和5.56
D.5.93和6.36 E.2.19和10.53
10、从赖氨酸中分离出谷氨酸的可能性最小的方法是( )A
A. 纸层析B. 阳离子交换层析 C. 阴离子交换层析D. 葡萄糖凝胶过滤 E. 电泳
11、__________用于确定多肽中C-末端氨基酸D
A Sanger试剂 B Edman试剂 C 两者均可 D 两者均不可
12、为从组织提取液中沉淀出活性蛋白最有可能的方法是加入()A
A. 硫酸铵B 三氯乙酸C 对氯汞苯甲酸 D 氯化汞
13、__________是一种去垢剂，常用在凝胶过滤中，以测定蛋白质的分子量D
A β-巯基乙醇 B盐酸胍C碘乙酸 D十二烷基磺酸钠
14. 肽Asp-Arg-Cys-Lys-Tyr-Ile-Gly用胰蛋白酶(T)和胰凝乳蛋白酶(C)处理,将产生（ ）A
A三个二肽和Tyr B 两个二肽和一个三肽 C Asp,Cys和一个二肽 D 一个二肽和一个五肽
15.蛋白质变性过程中,伴随着结构上的变化,其原因是C
a. 肽键的断裂 b. 氨基酸残基的化学修饰头物 c. 维系空间结构的氢键断裂 d. 二硫键的打开
16.茚三酮反应是A
a. 和a-氨基酸的.专一性反应 b. 测定蛋白质中肽键数量的反应c. 测定甘油三脂的反应 d. 测定多糖中糖苷键数量的反应
17、双缩脲反应是_________的特有反应D
a. DNA b. RNA c. 磷酸二酯键 d. 肽和蛋白质
18、有一蛋白质水解物,在pH6时,用阳离子交换柱层析,第一个被洗脱的氨基酸是A
a. Val(pI5.96)b. Lys(pI9.74) c. Asp(pI2.77)d. Arg(pI10.76)
e. Tyr(pI5.66)
19．对一个富含HiS残基的蛋白质在使用离子交换层析时，应优先考虑的是严格控制什么?B
(A)盐浓度 (B)洗脱液的pH (C)NaCl梯度(D)蛋白质样品上柱时的浓度
20．每个蛋白质分子必定具有的结构是什么?C
a．α-螺旋b. β-折叠c．三级结构 d．四级结构
填空题
1. 稳定蛋白质胶体状态的因素是蛋白质分子上的________及________.
2. 氢键有两个主要特征____________和_____________.
3. 两条相当伸展的肽链或同一条肽链的两个伸展的片断之间形成氢键的二级结构称为_______.
4. 破坏a-螺旋结构的氨基酸是_________和________
5. 测定蛋白质紫外吸收的波长,一般在____________,主要由于蛋白质中, 存在着_______, ______, __________残基侧链基团.
6. 蛋白质二级结构和三级结构之间还存在_______和_________两种组合体
7. 在分析蛋白质多肽链的氨基酸序列时,利用胰蛋白酶水解时,可断定被水解肽键的_________端是_________和________;利用胰凝乳蛋白酶水解时可断定被水解肽键的_________端是__________,___________,和___________.
简答题：
1. 蛋白质化学测序法的原则和程序可归纳为哪5个阶段?(仅需写出阶段名称)
1. 必须氨基酸及其三字母符号
2. 举出5种重要的氨基酸侧链功能团(化学结构式,功能团名称,各归属于何种氨基酸)
3. 凝胶层析的基本原理.凝胶层析的主要类型的名称
4. 蛋白质电泳基本原理及影响电泳速度的主要因素
综合题
1. 某九肽组成为两个Gly,两个Phe,Tyr,Met,Asp,Arg和Pro,经胰凝乳蛋白酶水解得五肽和四肽,四肽组成为Phe,Tyr,Gly和Pro.此九肽的CNBr处理产物经阳离子交换树脂层析并洗脱得一组成为Arg,Phe和Gly的三肽.此九肽经胰蛋白酶水解得Phe,如用FDNB反应后在水解测得DNP-Tyr.请写出此九肽顺序及解析过程。 分析过程：
（1）由“用FDNB反应后在水解测得DNP-Tyr.”得出该九肽的N末端为Tyr。
（2）因为经胰凝乳蛋白酶水解得五肽和四肽,四肽组成为Phe,Tyr,Gly和Pro. 又因胰凝乳蛋白酶只作用于Phe,Tyr, Trp的羧基形成的肽键，并且肽键不能作用于Pro的氨基形成的肽键。因此可推断出该四肽组成为Tyr-Pro-Gly-Phe
（3）由“九肽的CNBr处理产物经阳离子交换树脂层析并洗脱得一组成为Arg,Phe和Gly的三肽.”得出Met，Gly，Arg，Phe组成的四肽，以Met为N末端。
（4）因此九肽经胰蛋白酶水解得Phe,的出Arg-Phe，与（3）综合得出
Met-Gly-Arg-Phe
（5）由于九肽组成为两个Gly,两个Phe,Tyr,Met,Asp,Arg和Pro,因此由（2）（4）综合后得出该九肽为Tyr-Pro-Gly-Phe- Asp- Met-Gly-Arg-Phe
2. 水解肽A时,发现其含有等量的Arg,Val,Tyr,Glu,Lys,Ala和Gly七种氨基酸
1).用胰蛋白酶水解肽A时,得到如下物质:Arg,Ala-Lys和含有Glu,Gly,Tyr,Val的肽B;用胰凝乳蛋白酶水解肽B,产生两个二肽:Val-Tyr和Glu-Gly
2)肽A用羧肽酶短时间处理,产生游离的Glu是第一个可鉴定的氨基酸
3)肽A用DNFB法分析N端氨基酸,产生出DNP-Ala
问该肽A的氨基酸排列顺序是怎样的？
分析：
由（1）推断出A肽的序列有以下几种可能：Arg-Ala-Lys-Val-Tyr- Glu-Gly;
Ala-Lys -Arg-Val-Tyr- Glu-Gly; Arg-Ala-Lys-Val-Tyr -Gly- Glu; Ala-Lys -Arg- Val-Tyr -Gly- Glu;
由（2）推断出A肽的序列可能为Arg-Ala-Lys-Val-Tyr -Gly- Glu或者 Ala-Lys -Arg-Val-Tyr -Gly- Glu;
由（3）推断出A肽的序列为Ala-Lys -Arg-Val-Tyr -Gly- Glu;
蛋白质化学篇三：蛋白质化学总结
蛋白质化学
1、简述氨基酸的结构特点及两性解离特性。
答：
特点：
氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。在20种基本氨基酸中，除脯氨酸α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余L-α-氨基酸；每种氨基酸分子至少有一个氨基和一个羧基；至少有一个氨基和一个羧基链接在同一个碳原子上；各种氨基酸之间的区别在于R基团不同。
两性解离特性：
氨基酸分子在生理pH条件下形成了兼性分子（分子中含有等量的正电荷和负电荷，使该分子的净电荷为零）。氨基酸分子中除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在不同的pH溶液中可解离成正离子或负离子，因此氨基酸分子即可带有正电荷又可带有负电荷，这种性质称为氨基酸的两性解离。
2、蛋白质一级结构测定的原理和结果分析。
答：
准备：
样品必须纯（>97%以上）；确定蛋白质中所含的多肽链(亚基)的数目；二硫键的断裂；对每种亚基进行分离和纯化；确定亚基中氨基酸的组成。
①确定蛋白质分子中多肽链的数目，利用具有特异识别位点的蛋白酶将每条多肽链酶解成可以直接进行序列测定的短肽片段(包括断开多肽链内的二硫键)；
②分离并纯化各短肽片段；
③确定每条片段中的氨基酸顺序；
④利用不同识别位点的蛋白酶将多肽链酶解成不同的短肽片段，重复步骤①-③若干次；
⑤通过比较用不同的蛋白酶切割形成的短肽片段的序列，确定每条多肽链中氨基酸的顺序
N-端测序
1) Sanger法/DNFB法/二硝基氟苯法
2,4-二硝基氟苯（Sanger试剂）在碱性条件下，与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用层析法进行鉴定。
2) 丹磺酰氯（DNS）法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基发生酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有强烈的荧光基团，检测灵敏度比DNFB法高100倍。
3) Edman化学降解法/苯异硫氰酸酯/PITC法
首先在pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。从蛋白质或多肽氨基末端进行分析，不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
4) 氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的N-末端残基。 C-端测序
5) 羧肽酶法
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的C-末端残基。
6) 肼解法
多肽与肼在无水条件下加热，从多肽链上解离出C-端氨基酸，剩余部分变为肼化物，与C-端氨基酸分离。
⑥确定多肽链内及多肽链间的二硫键的位置。
（二硫键可以被过甲酸氧化或被硫醇还原而断裂。
过甲酸氧化可以断裂所有二硫键，但同时氧化Met残基，并破坏Trp侧链的吲哚基团。
硫醇（2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤苏糖醇）还原性裂解二硫键。）
（在测定多肽链的氨基酸序列之前，了解肽链中的氨基酸组成即每种氨基酸残基存在的数量是十分必要的。） ⑦将肽链完全水解以释放出所有的氨基酸，然后再对释放出来的氨基酸进行定量分析。
酸催化水解法、碱催化水解法、酶催化水解法、
3、对角线电泳法的原理及其应用。
原理
如果两次电泳间的特殊处理对蛋白质无影响，则电泳图谱中的蛋白点都在对角线上；如果该特殊处理对其有影响，则电泳图谱中的蛋白点偏离对角线。根据特殊处理的性质，可获得变化蛋白点的相关重要信息。目前其主要作用是膜蛋白的分离鉴定，及确定二硫键和蛋白质复合物的研究。
应用
水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次向成直角。在第二相电泳中，那些不含 -S-S-的电泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。
对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离 -S-S-肽的好方法。含 -S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的 -S-S-位置。
4、多肽固相合成的原理及其优点。
答：
原理
氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团保护氨基酸的共价连接在固相载体上，在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第?个氨基酸连接到固相载体上了。
然后第二个氨基被封闭的氨基酸的羧基通过N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的、第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要肽链长度。
最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的多肽。
优点
最初的反应物和产物都连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物，可以获得高产率产物，同时易于将产物分离。
5、在蛋白质定性、定量分析中常用的氨基酸的理化性质有哪些，如何应用。
答：
物理性质：吸光度差异
a.近紫外吸收(280 nm)
溶液中蛋白质的含量可以利用分光光度计进行测定。蛋白质在近紫外区的吸收主要依赖蛋白质中Tyr和Trp的含量(很少的因素来自Phe和二硫键)。因此在不同的蛋白质中，A280值会有很大的差异。
b.远紫外吸收
肽键在约190nm的远紫外区具有很强的光吸收；
由于氧气在该波长段的干扰以及传统分光光度计在该波长的灵敏度低，所以测量通常选择205nm，蛋白质在205 nm处的吸收将是在190nm处的一半；
含有不同侧链的氨基酸，包括Trp，Phe，Tyr，His，Cys，Met，Arg的侧链(递减的顺序)对于A205均有贡献。 化学性质
c. Lowry法
Lowry法是以双缩脲反应为基础的一种方法。
蛋白质的肽键可以在碱性条件下与铜作用形成络合物，然后与Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)发生反应，具体的反应机理还不清楚，大体上是由于铜催化的芳香族氨基酸的氧化作用能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，反应最终生成具有蓝色的物质，颜色的强度与蛋白质中Trp、Tyr的含量有关
d.BCA法(The Bicinchoninic Acid Assay)与Lowry法非常类似，原理上也是依赖于在碱性条件下Cu2+转变为Cu+的反应。然后利用Cu+与BCA反应形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
e.考马斯亮蓝G-250比色法
由于G250所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。
f.利用微波快速蛋白质定量法
利用微波的射线可以使得蛋白质检测实验中的温育从标准的15～60min缩短至几十秒。这种方法是建立在Lowry法和BCA法标准蛋白分析法的基础上的：
当微波穿过样品时，样品内的分子就暴露在连续变化的电磁场中，被电离极化的分子将沿着电磁场的方向进行排列并随着场强的变化而快速旋转。场强越高则分子旋转的速度越快。而微波频率和可极化的分子大小存在着一定的关系。在常规微波炉所使用的2.45GHz下，只有小分子才会旋转，尤其是水分子，但是蛋白质不能旋转。
在微波炉中，样品中水分子旋转能的一部分会以热能的形式释放。由于样品中这些小分子能够高速旋转，所以微波炉能够提供非常有效的加热，并且一般的微波产生的热效应能引起局部温度的变化。同时还发现微波同时能够引起蛋白质分析时反应产物形成的速率，这种加速与温度的变化无关。
6、测定蛋白质的分子量的方法有哪些？各自的原理是什么？请通过比较说明各种方法的优缺点。
①SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
蛋白质分子状态
在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子，在电场下向与自身电荷相反的方向移动。
还原剂的解聚作用
在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol，DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。
SDS的包裹作用
SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物(protein-SDS micelles)。由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，移动的速度与蛋白质本身带是什么样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质可以测定蛋白质的分子量。
聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用
不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，走在大分子的前
面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。
未知蛋白分子量计算：
相对迁移率mR=蛋白条带迁移距离(cm)
染料迁移距离(cm)将未知蛋白的mR值查到log(M)值，便可知其分子量。计算分子量方法除了用标准曲线法外，还可以用比较法和机读法。
（比较法:
用标准蛋白的相对位置与未知蛋白的位置进行比较，初步判断。这是在发表论文时常用的表示方法。
机读法：
用凝胶扫描仪，将凝胶图谱扫描输入计算机中，通过影像文件系统处理，便很快得知未知样品的分子量。但发表论文时，仍然要注出原始图谱，因为经计算机处理的图谱有作假之嫌。）
优点：操作方便、分辨率高、样品用量少、重复性好。
缺点：对电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的相对分子质量不太可靠。
②凝胶过滤层析
凝胶过滤层析(Gel filtration)，也称为分子筛层析、凝胶排阻层析(Exclusionchromatography)。凝胶过滤层析介质是以不同浓度的凝胶交联聚合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶过滤层析介质对蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶过滤层析分离的过程中，大分子先流出，小分子后流出。
标准曲线法
分子量的测定一般都采用标准曲线法。使用几种不同分子量的混合标准蛋白，经排阻色谱进行分离会得到不同保留值的色谱峰，以分子量的对数值(lgMr)为纵坐标，以收集体积(ml)为横坐标，绘制标准曲线图。然后将未知样的标留体积在标准曲线上查得分子量。未知蛋白分子量计算：将未知蛋白排阻层析的洗脱体积从标准曲线上查到相应的log(M)值，便可求出其分子量。
优点：不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行。不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，对于高分子物质有很好的分离效果。
缺点：由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分辨率不高，分离操作较慢。
③质谱法
质谱法是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的方法。
ZeU=mv2e=1。60×10?19 U：加速电压 m：离子的质量Z：电荷数v：离子被加速后的运动速度
具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。 优点：广谱性检测，几乎能测量所有物质的成份、结构；消耗样品少；灵敏度、分辨率、精确度都很高；方便串联其他仪器，形成组合，提高验证效率。
缺点：经处理后，分子无生物活性；质谱仪器昂贵，维护极难。
7、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法都是根据分子大小而对蛋白质进行分离的，并且都使用交联聚合物作为支持介质，为什么在前者是小分子比大分子更易留，而在后者则恰恰相反？
答：凝胶层析与分子筛孔隙有关，其固定相是多孔凝胶，小分子会进入凝胶内孔隙，而大分子则在凝胶间隙中流动。小分子比大分子走过的路径长，所以小分子比大分子更易留在凝胶内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质与阴离子表面活性剂结合，降低或者消除了蛋白质的表面电荷，使其带负电荷，同时，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的结构，而分离胶中的孔径大小一致。大分子遇到的阻力比小分子大，所以大分子比小分子更易留在凝胶内。
8、说明凝胶过滤层析的原理，它的用途有哪些，请列出3-5种？
答：
原理：
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，本身像个"筛子”，不同类型凝胶的筛孔的大小不同。当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
用途：
脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去。
提纯：除去分子量差别较大的杂蛋白。
分离不同分子量的蛋白质：若流速恒定的条件下，其保留时间也是一定的，所以凝胶过滤层析根据蛋白质不同的分子量可得到不同的保留体积，从而分离不同分子量的蛋白质。例如，分离同一蛋白的二聚体、三聚体、多聚体等形式。
测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
研究蛋白质配体有无相互作用：大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用。以凝胶为亲和层析的载体，对蛋白质-蛋白质复合物进行电泳，对比两种蛋白质单体的条带，可探知两种蛋白质是否有相互作用
9、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(IEF)的原理。
答：
（蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子，蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。）
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，其分辨率一般达到0.01个pH值，最高可达到0.001个pH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。
10、蛋白质翻译后加工与修饰有哪些形式、各有什么生物学意义？
答：
①N-端fMet或Met的切除：蛋白质前体蛋白质在去掉N端一部分残基后变成有功能的蛋白质。
②二硫键的形成：两个半胱氨酸硫氢基可以氧化成二硫键，产生mRNA中没有相应密码子的胱氨酸。二硫键的正确形成对稳定蛋白质的天然构象具有重要的作用。
③剪切：在生物中有些蛋白要经过切除才能成为有活性的成熟蛋白。
④化学修饰
1) 磷酸化
磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将NTP(s)的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。
可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导肿瘤发生新陈代谢、神经活动肌肉收缩以及细胞的增殖发育和分化等。
2) 糖基化
糖基化修饰指在蛋白质肽链上加上短链的碳水化合物残基（寡糖或聚糖）的修饰。
(O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化、GPI (glycophosphatidlyinositol)锚定连接)
(O位糖基化多发生在临近Pro的Ser或Thr残基上，糖基化位点处的蛋白多为β构型。O位糖基化反应
发生在细胞内两个部位，一是发生在高尔基体上，一是发生在细胞核或细胞质中。N位糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的Asn的氨基上结合寡糖的过程；C位甘露糖化是将一分子α-mannopyranosyl残基通过C-C键连接到Ser吲哚环C-2上；GPI锚定连接指的是磷脂酰-纤维糖组在靠近蛋白C端部位结合，将蛋白连接到细胞膜上。)
糖基化是真核细胞中特有的加工，这些蛋白质常和细胞信号的识别有关，如受体蛋白等。实际上几乎所有的分泌蛋白和膜蛋白都是被糖基化的蛋白。
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