细胞培养注意事项

细胞培养的过程及注意事项推荐度：
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细胞培养注意事项

　　细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。下面是小编整理的细胞培养注意事项，仅供参考，大家一起来看看吧。

　　无菌操作基本技术

　　1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

　　2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

　　3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

　　4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。

　　5.定期检测下列项目：

　　5.1.CO2钢瓶之CO2压力

　　5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

　　5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

　　6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水

　　请问工作浓度的胰酶是不是应保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是几个小时就会失去活性？

　　平时放在-20度，分装在50毫升螺口管，用时拿一管放4度用。

　　1.认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败

　　2.粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。

　　3.关于实验用品的清洗与消毒，我的经验是：用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)，捞出晾干，再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。

　　许多塑料制品也可以高压消毒，例如培养瓶盖，胶塞，吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了，当然如果money有限，如进口的培养板、皿等，也可以重复使用1-2次，我当时使用方法是将其完全清洁后，使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可，我做过多次，没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便，最好不要重复使用，如一定要重复用，可用环氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

　　在光镜下，上皮细胞通常呈“铺路石”样排布，细胞之间有拉丝现象（即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连），细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形，没有有成片生长的特性，细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变，如HeLa细胞是上皮细胞，但是在酸性培养条件下会变为梭形。

　　上皮细胞之间都有特征性的紧密连接（桥粒）结构，因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型，如果有紧密连接，就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜，要用细胞刮刮下来后做电镜。

　　此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达,可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子，然后进行免疫细胞化学的鉴定，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。

　　细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。

　　另外关于培养基的pH问题，一般按照说明书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。

　　（1）东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。

　　（2）我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。

　　（3）一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。

　　（4）整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。

　　（5）我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后，最好找个毛巾插干上面的水。

　　（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作台，要打扫卫生。

　　细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。

　　过滤时不要用枪吹细胞!!如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎!!

　　.刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。

　　做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。

　　对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。

　　新配的培养基直接用很清亮，但是在－20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。

　　操作中的安全：

　　a、我犯的一个巨经典的错误至今难忘，刚做时酒精擦手，擦镊子，湿淋淋的就拿镊子过火，结果火顺着镊子着到手上，虽然不怎么热，可是我手上的汗毛啊，555，都被烧了。这个错误以后再也没犯。

　　b、过完火的试管口一定不能摸，时刻记着只拿试管的下1/2。

　　c、给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管，否则终身难忘。

　　d、当酒精灯出现什么意外时一定要镇静，先让他着一会可能没事，不要慌乱中打坏别的东东。

　　e、离心机尤其高转速时，配平当然要牢记，可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东（有一次我离东西，着急，放进去刚离一会我就觉得声音不对，打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子）。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心，结果吓个半死，原来别人正在离心，幸好管子没飞出来

　　细胞冻存：当细胞状态好，或者代数比较早，一定要大量冻存，不要吝惜暂时的大批使用血清，当细胞状态不好，长不起来的时候，马上取出来复苏，省时省力，不要去尝试努力恢复状态不好的细胞，费时间也费血清，会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一点，谁也不敢保证不出意外，冰箱也可能有化的时候（我们－20度冰箱就化过），都放在一块容易全军覆没。

　　按照试剂的保存标准保存，象血清、胰酶等没开封的-20℃，开封后-4℃保存一般不超过7天（用完它吧，不然浪费了）

　　5、一定要弄清楚每个组分的作用，特点，比如NaHCO3容易分解，因此培养基在过滤除菌时pH会上升，一般是0.1-0.3，所以在过滤之前，要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点，就不会做相应的处理，那么培养基不符和要求，细胞就长不好。

　　台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

　　细胞培养要注意这22点！

　　1.细胞培养前的准备

　　在开始细胞培养之前，先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足，以免在开始实验后再次出入操作台，这样可以降低细胞污染的风险。

　　细胞培养基也应先预热，选择只预热部分培养基而非整瓶加热，不但可以节约实验时间，而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解。

　　结束操作后，需尽可能避光保存。

　　2.细胞培养的定期检查

　　定期检查培养细胞的形态，即形状和外观，对于细胞培养实验取得成功至关重要。

　　除确认细胞的健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。

　　3.细胞变质的征象

　　细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。

　　这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。

　　变质严重时将会成为不可逆的变化。

　　4.细胞培养通风橱的消毒及布局

　　①保持细胞培养通风橱内的整洁有序，将所有物品置于直视范围内。

　　②向放入通风橱内的所有物品喷洒70%乙醇，擦拭清洁进行消毒。

　　③在通风橱中部开阔处放置细胞培养容器；移液器置于右前方易于取用；试剂和培养基置于右后方便于吸取；试管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放废液。

　　5.培养瓶/皿等物品的无菌操作

　　无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境中，操作完成后尽快盖上盖子，取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。

　　进行无菌操作时不要说话、唱歌或吹口哨。尽快完成实验，以尽量避免污染。

　　6.细胞培养中可能的污染物

　　细胞培养污染物主要分为两类：

　　①化学污染物,如培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂。

　　②生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。

　　可通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度。

　　7.交叉污染的确认

　　交叉污染虽不如微生物污染普遍，但与HELA细胞及其他生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是个明确的问题，会造成严重后果。

　　从声誉好的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系性质及采用良好的无菌技术有助于避免交叉污染。

　　通过DNA指纹图谱、核型分析和同位素分析可确认有无交叉污染。

　　8.细胞换液注意事项

　　为细胞换液时，要沿着培养瓶的一侧轻轻地加入，而不是直接加到细胞中，以免损伤细胞，当培养的细胞株较为脆弱时尤其需要注意。

　　使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体时，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

　　9.细胞传代的时间把握

　　当细胞呈指数增殖，贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或悬浮培养的细胞已超过培养基质所支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止。

　　为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激进一步增殖，必须对细胞进行传代。

　　10.细胞培养中使用抗生素的注意事项

　　细胞培养时不应长期使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。抗生素只能作为对付污染的最后手段短期使用，并尽快撤除。

　　如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。

　　11.细胞冻存的必要性

　　连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限细胞系最终会发生衰老，所有培养的细胞都易受到微生物污染，即使运转情况最好的实验室也会遇到设备故障的问题。

　　由于已建立的细胞系是一种宝贵资源，更换细胞系成本高昂，而且耗费时间，因此，必须将其冷冻起来，长期保存。

　　12.细胞冻存的事项

　　应在细胞浓度高的情况下进行细胞培养冻存，并且细胞传代的次数尽可能少。

　　在冻存前确保活细胞的百分比至少为90%。

　　请注意，最佳冻存条件取决于所用细胞系。

　　冻存和复苏过程对大多数细胞都会造成不利影响，因此不要通过涡旋震荡或者用力敲打培养瓶的方法使细胞脱落（培养昆虫细胞时除外），也不要高速离心细胞。

　　13.冻存培养基的选择

　　冻存细胞时必须选择冻存培养基，冻存培养基中应含有DMSO或者甘油等冷冻保护剂。还可使用专门配制的完全冻存培养基，例如HyClone、Gibco的细胞冻存培养基。

　　14.细胞培养温度的设定

　　细胞培养的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受到解刨部位体温差异的影响，例如：皮肤温度低于骨骼肌的温度。

　　与温度过低相比，细胞培养时温度过高时更为严重的问题：因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。

　　15.各类细胞培养的最佳温度

　　大多数人和哺乳动物细胞系在36℃~37℃下具有最佳生长状态。昆虫细胞在27℃具有最佳生长状态；在低于27℃以及27至30℃范围内，细胞生长较慢。温度超过30℃时，昆虫细胞活力降低，即使温度降至27℃，细胞活力也无法恢复。禽类细胞系在38.5℃时具有最佳生长状态。虽然此类细胞也可在37℃下培养，但其生长速度会变慢。

　　来源于冷血动物（例如：两栖动物、冷水鱼）的细胞系可耐受很宽的温度范围，为15-26℃。

　　请注意每种细胞的培养条件均有所不同，偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完全失败。

　　16.细胞培养的最适pH

　　大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。

　　但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境中即pH7.0-7.4时生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境即pH为7.4-7.7。

　　Sf9和Sf21等昆虫细胞系最适合在pH值为6.2的环境中生长。

　　17.细胞培养基最适pH的控制

　　细胞培养基可控制培养体系的pH值，为培养的细胞缓冲pH值的变化。

　　这种缓冲作用通常是通过添加有机缓冲盐（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐实现。

　　由于培养基的pH值取决于溶解态二氧化碳与碳酸氢盐间的精密平衡，因此空气中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。

　　为此，使用二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐培养基时必须使用外源性二氧化碳，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者进行高浓度的转化细胞系培养时。

　　18.细胞培养中血清的保存

　　细胞培养中所用的血清不尽相同，您需要根据您所培养的细胞种类和培养要求来挑选出最适合的血清。建议将血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。若无法一次用完一瓶，建议将血清无菌分装至合适体积的灭菌容器内，再放回冷冻箱保存。

　　解冻血清时，建议将血清从冷冻箱取出后，先置于2-8℃冰箱过夜融解，然后在室温下使之全融。需要注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

　　19.如何在细胞铺板时避免“边缘效应”

　　细胞实验铺板时，为避免“边缘效应”，以应用96孔板的中间60孔为最佳，一般四周的一圈边缘孔不养细胞，只做空白或阴性对照。

　　铺板时，细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来而导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就再混匀一下。

　　加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练操作，尽快上板。

　　20.何时选择使用热灭活血清

　　加热血清可以灭活补体系统。

　　启动的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　21.热灭活血清可能出现的现象

　　在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　而对于其他大多数的细胞来说是不需要热灭活血清的。

　　热灭活血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至可能因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低；经过热处理的血清，沉淀物会显著地增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37度环境中，又会使此沉淀物增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

　　可以根据您的研究需要选择是否需要热灭活血清。如此一来，不但能确保血清的质量，而且能够节省时间。

　　22.如何正确热灭活血清

　　热灭活时请将血清置于56℃水浴30分钟。

　　为尽量减少热灭活对血清品质的影响，一次灭活的血清体积不宜过大。

　　最好准备同样的容器装相等体积的水（与血清相同温度），灭活时将装有血清和水的容器同时放入56℃水浴，在装水的容器中放置温度计，加热过程中不时地轻轻旋转混匀血清，当温度计显示达到56℃左右，开始计时。

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