真菌的鉴定

真菌的鉴定

麦曲在黄酒酿造中起着重要的作用。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理顺麦曲中的微生物与产地环境的相互关系、建立麦曲微生物生态数据库和麦曲品质的分子评价指标，具有重要的指导意义。

不同培养基进行真菌平板分离的结果

文章来源华夏酒报

为了最大限度地分离出麦曲中的真菌，采用了三种培养基，其中PDA和CPK培养基是用来分离真菌的常用培养基，此外还使用了麦曲浸提液培养基(WQE)，因为它的营养成份近似于微生物最原始的生存环境。对于三种培养基进行平板菌落计数，PDA和WQE培养基上的菌落数在48小时后达到最大，菌落数分别达到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CPK培养基上，由于本身是合成培养基，营养不够丰富，所以24小时后开始慢慢形成菌落，56小时后达到最大值，仅为1.4×104 cfu/g干曲。

不同培养基的麦曲真菌分布

根据菌落大孝形态和颜色等表型特征进行初步区分，共得到24株纯种菌株。各个纯株在3种分离培养基上的分布情况见表1。从PDA，CPK和WQE三种培养基上分离得到的纯种真菌分别为8种、18种和11种。PDA是营养丰富的培养基，但分离出来的真菌数目最少。而近似于微生物最原始生存环境的WQE培养基分离得到的真菌种类，要比预期的少。在合成培养基CPK上分离获得的真菌种类最多，暗示在低营养长时间的培养条件下，能够较多地回收得到麦曲样品中的真菌。

将10—5稀释度以上检测到的真菌认为是麦曲样品中的优势菌。从表中可以看出，不同的培养基分离出来的优势菌是不一样的，且每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株，所以必须联合使用多种分离培养基，才能准确解析麦曲中的真菌多样性。另外，在分离培养基中有必要加入去氧胆酸钠来抑制菌丝的蔓延。

纯种真菌的鉴定

对分离获得的24株真菌纯株进行形态初步鉴定和基于ITS序列的分子鉴定，具体测序结果见表 综合平板分离和测序的结果可以看出，通过大规模的系统分离培养方法确定麦曲中的优势真菌为：伞枝犁头霉(Absidia corymbifera—like)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏毕赤氏酵母(Pichia guilliermondii)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)。

本研究分离鉴定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(Penicillium citrimum)、季氏毕赤酵母、异常毕赤酵母，小孢根霉，多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛壳霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和Phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究结果中均未出现。所用的麦曲是人工脚踏成型，此前公司采用培养法对机制麦曲中的真菌进行过研究，机制麦曲中的优势真菌为伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外，其余优势真菌与本文的研究结果一致。

人工脚踏成型麦曲中的真菌种类比机械压制成型麦曲丰富，其原因是人工踩制曲坯能起到提浆作用，赋予曲坯表面较丰富的营养和较好的保温功能，因而比机械压制成型的曲坯更适合微生物的生长繁殖。

对分离获得的真菌纯株序列进行系统发育分析发现，所分离得到的纯种菌株大致分为11个属，分别是曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopusmucor)、毛霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、散囊菌属(Eurotium)、枝孢属(Cladosporium)、毕赤酵母属(Pichia)、球毛壳属(Chaetomium)、念珠属(Candida)和伊萨酵母属(Issatchenkia)，反映出绍兴黄酒成品麦曲中真菌的资源非常丰富。从属的分类水平来看，在脚踏曲中出现的属除了散囊菌属(Eurotium)、毕赤酵母属(Pichia)和球毛壳属(Chaetomium)外，其它的属在机制曲中均有出现。

本文所得到的序列用菌名加代号表示，来自于GenBank数据库的序列用菌名加登录号表示。比例尺代表5%的核酸序列差异性。

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